Yêu cầu cho Chuẩn bị Mẫu Cryo-EM- Một bước quan trọng trong quy trình làm việc của Cryo-EM

Mẫu Cryo-EM thường là một dung dịch của các vật liệu sinh học bao gồm các protein, phức hợp protein, virus hoặc các cao phân tử khác. Bởi vì việc chuẩn bị mẫu là một bước cực kỳ quan trọng trong quy trình làm việc của Cryo-EM, việc hiểu rõ các bước chuẩn bị mẫu và sở hữu bộ dụng cụ phù hợp là rất cần thiết.

• Thermo Fisher Scientific cung cấp một ứng dụng hỗ trợ quy trình (trên iPad) để hướng dẫn người dùng qua các bước chính của việc chuẩn bị mẫu Cryo-EM.
• Nhiều quy trình khác nhau cho việc chuẩn bị mẫu Cryo-EM đã được phát triển và công bố. Việc chọn quy trình tốt nhất chủ yếu phụ thuộc vào loại vật liệu mẫu.
• Trình quản lý các quy trình đã khách hàng thành công của chúng tôi cung cấp một số đề xuất thực tiễn cho các phòng thí nghiệm chuẩn bị mẫu.
• Có bộ thiết bị cần thiết để chuẩn bị mẫu Cryo-EM được cung cấp có sẵn.
• Mẫu nghiên cứu phải đáp ứng các yêu cầu sau:
• Tính tinh khiết rất cao (>99%) (một band đơn trong gel SDS-PAGE)
• Sự không đồng nhất về thành phần tối thiểu (một đỉnh đơn trong phổ SEC chromatography)
• Sự không đồng nhất về cấu trúc tối thiểu (tức là cấu trúc ở một hoặc chỉ một vài trạng thái khác nhau)

Để chuẩn bị một mẫu Cryo-EM phù hợp cho việc thu thập dữ liệu độ phân giải cao, thường sẽ thực hiện các bước sau:

·        Tinh chế Protein

·        Đánh giá chất lượng mẫu

·        Bảo quản mẫu

1.     Tinh chế protein

Mặc dù quy trình phân tích hạt đơn có thể giảm bớt sự không đồng nhất một phần trong mẫu thông qua các quá trình phân loại 3D, việc tinh chế mẫu sinh học để thu được dung dịch của các protein mục tiêu là bắt buộc.

Các mẫu Cryo-EM thường được chuẩn bị bằng vài microliters dung dịch protein ở nồng độ dao động từ 50 nM đến 5 μM, tùy thuộc vào mẫu, lưới EM và điều kiện sử dụng. Mẫu sinh học được nghiên cứu nên duy trì hoạt động trong điều kiện tối ưu in vivo (thành phần dung dịch đệm vv.) cho các nghiên cứu cấu trúc. Các phép thử hóa sinh phù hợp cũng có thể được sử dụng để kiểm tra hoạt tính của protein. Các phương pháp sinh học và vật lý hóa học phổ biến được sử dụng để đánh giá thành phần và tính đồng nhất của mẫu protein là:

• Sắc ký gel polyacrylamide (SDS-PAGE)

• Sắc ký rây phân tử (SEC)

• Tán xạ ánh sáng động (DLS)

Thường, hầu hết các kỹ thuật này sẽ có sẵn trong các phòng thí nghiệm sinh hóa thông thường. Do đó, ít hoặc không cần phải đầu tư thêm cho phần sinh học của việc chuẩn bị mẫu Cryo-EM.

2.     Đánh giá chất lượng mẫu

Một phương pháp dễ dàng và trực tiếp để đánh giá chất lượng của mẫu sinh học được tinh chế ở tỷ lệ rất nhỏ là kính hiển vi điện tử nhuộm âm tính. Mục tiêu của việc sàng lọc này là đánh giá chất lượng đồng nhất về thành phần và cấu trúc của các hạt. Việc đánh giá này chỉ có thể được thực hiện ở tỷ lệ vi vi mô.

Thông thường, việc đánh giá chất lượng sinh học này được thực hiện trên một kính hiển vi TEM (ví dụ: Thermo Scientific™ Talos™ L120C TEM hoặc Thermo Scientific™ Talos™ F200C TEM), vì việc sàng lọc thường được thực hiện một lưới một lần, và thời gian thực tế trên kính hiển vi ngắn.

Ngoài ra, việc sàng lọc để đánh giá chất lượng sinh hóa cũng có thể được thực hiện ở điều kiện đông lạnh, điều đó có nghĩa là nó sẽ được kết hợp với việc sàng lọc các mẫu ngậm nước đông lạnh, được mô tả trong phần tiếp theo.

3.     Bảo quản mẫu

Để tương thích với chân không của kính hiển vi điện tử và để khóa các hạt riêng lẻ tại chỗ, dung dịch chứa vật liệu mẫu phải được đông lạnh. Để bảo tồn cấu trúc cao phân tử mà không bị hư hại, quá trình đóng băng phải diễn ra đủ nhanh để tránh hiện tượng băng kết tinh. Điều này được thực hiện bằng cách giảm nhiệt độ siêu nhanh. Sau đó, mẫu phải được giữ ở nhiệt độ nitrogen lỏng trong suốt thời gian để bảo quản tính vô định hình của lớp băng nhúng và tránh làm hỏng các hạt sinh học (protein).

Thao tác này tạo ra một mẫu ngậm nước đông lạnh, trong đó các phân tử riêng lẻ của mẫu được nhúng trong một lớp băng vô định hình (thủy tinh) rất mỏng và phân bố đều trong băng.

Toàn bộ quy trình có thể được đơn giản hóa bằng cách sử dụng Hệ thống Thermo Scientific™ Vitrobot™. Dựa trên một tập hợp các thông số chính, chẳng hạn như thời gian thấm mẫu, lực thấm, độ ẩm tương đối và nhiệt độ, điều này cho phép sự ổn định và sai số thấp cho các mẫu tinh thể hóa chất lượng cao.

Kính hiển vi điện tử lạnh của Thermo Scientific sử dụng các bộ mang mẫu AutoGrid được cấp bằng sáng chế. Các AutoGrid này là tiêu chuẩn ngành công nghiệp cho việc tải và dỡ mẫu một cách mạnh mẽ và đáng tin cậy bằng cách sử dụng một bộ tải mẫu robot tại nhiệt độ cryogenic. Các AutoGrid cũng cho phép trao đổi mẫu một cách hoàn hảo giữa các kính hiển vi khác nhau trong quy trình làm việc bằng khả năng kết nối được thiết kế sẵn.

Để biết thêm chi tiết cho quá trình chuẩn bị mẫu cho hệ thống Cryo-EM, xin vui lòng liên hệ:

Nguyễn Thủy- 0969048489

Thạc sĩ CNSH- SHPT và Cấu trúc protein