Khả năng tương thích của mẫu với Hydra Bio Plasma-FIB
Thứ ba, 18/02/2025
Hình ảnh 3D của mô não chuột được nhúng trong nhựa acrylic và epoxy
Trong những năm gần đây, công nghệ kết hợp phay chùm ion hội tụ và kính hiển vi điện tử quét (FIB-SEM) đã trở thành công nghệ chủ chốt trong khoa học sự sống và đang nhanh chóng trở thành một công cụ mạnh mẽ để phân tích thể tích 3D và chụp ảnh siêu cấu trúc của các mẫu sinh học.
Các hệ thống FIB phổ biến nhất hiện nay là các nguồn ion kim loại lỏng (liquid metal ion sources - LMIS), thường là gali. Mặc dù các công cụ LMIS đã được sử dụng phổ biến cho hình ảnh 3D sinh học, các hệ thống FIB-SEM gali lại bị hạn chế bởi thông lượng và khả năng tương thích của mẫu. Quy trình chuẩn bị mẫu chung bao gồm cố định hóa học, tương phản kim loại nặng và nhúng nhựa. Đối với phân tích FIB-SEM thông thường, các mẫu được nhúng trong nhựa gốc epoxy mật độ cao như EPON hoặc Durcupan, vì những yễu tố này ít có khả năng gây ra các hiện tượng lỗi trong quá trình phay.
Người ta biết rõ rằng phản ứng bức xạ của nhiều loại nhựa khác nhau là rất khác nhau. Nhựa gốc Acrylic (ví dụ LR White) có xu hướng tạo ra các hiện tượng lỗi nghiêm trọng trong quá trình phay, chẳng hạn như hiện tượng màn che (xem hình 2B), ngay cả ở liều lượng thấp. Do độ ổn định kém này dưới FIB gali, việc sử dụng nhựa acrylic trong phân tích FIB-SEM 3D bị hạn chế rất nhiều.
Gần đây hơn, các hệ thống FIB-SEM với nguồn ion plasma cảm ứng (inductively coupled plasma - ICP) đã được giới thiệu, có khả năng cung cấp dòng điện cao hơn gấp nhiều lần (lên tới 2,5 µA). The Thermo Scientific™ Helios Hydra™ Bio Plasma FIB là một FIB plasma (PFIB) SEM có khả năng độc đáo giúp cung cấp bốn loại ion (Xe, Ar, O hoặc N) làm nguồn chùm ion, cho phép các nhà nghiên cứu tìm ra chùm ion tối ưu cho mọi mẫu. Helios Hydra Bio luân phiên giữa việc phay chùm ion của khối mẫu và chụp ảnh bề mặt tiếp xúc bằng SEM. Điều này tạo ra một chồng hình ảnh 2D có độ phân giải cao có thể được kết hợp thành hình ảnh 3D của mẫu, cho thấy các đặc điểm của vùng quan tâm ở độ phân giải nano (Hình 1).
Tối ưu hóa nguồn của chùm ion cho các mẫu sinh học
Khi chuẩn bị mẫu sinh học để phân tích, phương pháp chuẩn bị mẫu và loại nhựa quyết định mức độ bảo quản tốt các cấu trúc dưới tế bào và tín hiệu huỳnh quang. Trong ghi chú ứng dụng này, chúng tôi đã khám phá việc sử dụng một số loại ion (Ga, Xe, O và N) trên mô não chuột được cố định hóa học và nhúng trong nhựa LR White (gốc acrylic) và EPON (gốc epoxy).
Các mẫu mô não chuột được cố định trong dung dịch đệm glutaraldehyde, paraformaldehyde và natri cacodylate, sau đó được cố định bằng osmium tetroxide và kali ferrocyanide. Hàm lượng kim loại nặng tăng trong mẫu cải thiện độ tương phản của hình ảnh SEM, do đó bước cố định được tiếp nối bằng cách nhuộm thêm bằng uranyl acetate và chì aspartate. Sau khi cố định và nhuộm, quá trình khử nước đã loại bỏ toàn bộ nước còn lại trong mô. Sau đó, các mẫu được thấm với nồng độ epoxy (EPON) hoặc nhựa acrylic (LR White) tăng dần và được polymerized. Các mẫu nhuộm và nhúng được cắt thành thể tích ~1 mm3 và phủ một lớp vàng mỏng.
Hình 2 cho thấy kết quả so sánh sau khi phay Ga-FIB và PFIB đối với mẫu nhựa LR White. Việc sử dụng cả nguồn ion gali và xenon dẫn đến hiện tượng che phủ, trong khi oxy và nitơ làm cho bề mặt khối mịn hơn. Ngoài ra, oxy cho thấy hiệu quả phay tốt hơn so với nitơ.
Hình ảnh khối lượng 3D
Nguồn ion oxy (30 kV, 0,23 nA) được sử dụng để phay mẫu nhúng trong EPON, với độ dày lát cắt là 4 nm (thời gian phay 22 giây cho mỗi khung hình). Đối với mẫu nhúng LR-White, O+ (30 kV, 0,61 nA) được sử dụng để phay các lát cắt dày 10 nm (thời gian phay 20 giây cho mỗi khung hình). Điều quan trọng cần lưu ý là có thể sử dụng các dòng chùm tia phổ biến hơn, cao hơn (lên đến 45 nA); những dòng này sẽ đẩy nhanh hơn nữa quá trình phay. Sau khi phay từng lát cắt, một hình ảnh điện tử tán xạ ngược được thu bằng cách sử dụng máy dò trong cột (in-column detector - ICD) hoặc qua thấu kính (through-lens detector - TLD) ở chế độ có độ phân giải cực cao (2 kV, 200 pA).
Kết luận
Khi chuẩn bị mẫu sinh học để phân tích, phương pháp chuẩn bị mẫu và loại nhựa quyết định mức độ bảo quản các cấu trúc dưới tế bào và tín hiệu huỳnh quang. Trong ghi chú ứng dụng này, chúng tôi đã so sánh khả năng tương thích của mẫu với các ion khác nhau (Xe, Ga, O và N) với các mẫu mô não chuột được nhúng trong nhựa gốc epoxy và acrylic.
Chúng tôi đã chứng minh rằng quá trình phay oxy tạo ra bề mặt không có màn chắn, ngay cả đối với mẫu nhúng acrylic, thường là thách thức đối với quá trình phay FIB.
Kết hợp với việc thu thập dữ liệu tự động, quá trình phay oxy tạo ra hình ảnh chụp cắt lớp FIB-SEM với chất lượng hình ảnh tuyệt vời cho cả mẫu nhúng EPON và LR-White. Oxy được phát hiện là chùm ion đa năng, đặc biệt phù hợp cho các nghiên cứu siêu cấu trúc của mẫu sinh học, bất kể phương pháp chuẩn bị nào.
Thermo Scientific Hydra Bio Cryo-Plasma FIB cho phép bạn:
- Tạo ra bề mặt nhẵn, không có hiện tượng rèm che trên mẫu với bất kể loại nhựa hoặc phương pháp chuẩn bị mẫu nào
- Thực hiện phay nhanh và hiệu quả, mà không ảnh hưởng đến chất lượng, để tiếp cận khối lượng lớn hơn 10 lần so với khối lượng được phay bằng nguồn gali
- Sử dụng phương pháp thu thập dữ liệu 3D tương tự như hình ảnh khối mặt nối tiếp, nhưng với các lát mẫu dày cỡ nanomet
- Truy cập thông tin đa phương thức dưới bề mặt và 3D với mục tiêu ROI chính xác bằng Phần mềm Auto Slice & View
Đọc thêm
Li, S., Raychaudhuri, S., Lee, S.A. et al. (2021) Asynchronous release sites align with NMDA receptors in mouse hippocampal synapses. Nat Commun 12:677. doi: 10.1038/s41467-021- 21004-x
Gorelick, S., Korneev, D., Handley, A., et al. (2018) Oxygen plasma focused ion beam scanning electron microscopy for biological samples. bioRxiv 457820. doi: 10.1101/457820
Để biết thêm chi tiết về Hydra Bio Plasma-FIB và Application Note hoàn chỉnh, xin vui lòng liên hệ ADGroup
