Quét và phân tích Microarrays bằng Máy chụp ảnh phân tử sinh học Sapphire FL

Scanning Microarrays with the Sapphire FL Biomolecular Imager

Quét và phân tích Microarrays bằng Máy chụp ảnh phân tử sinh học Sapphire FL

Giới thiệu

Vi mảng DNA cho phép thử nghiệm song song hàng trăm hoặc hàng nghìn mục tiêu cùng lúc. Phân tích vi mảng là một phương pháp lai, điều tra xem liệu một chất trong mẫu có thể gắn vào mục tiêu cố định hay không. Vi mảng đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu biểu hiện gen và thực hiện genotyping, và có một phạm vi ứng dụng rộng lớn trong nghiên cứu và lâm sàng. Điều cốt yếu cho việc sử dụng vi mảng trong bất kỳ ứng dụng nào là khả năng hình ảnh hóa và thu thập dữ liệu định lượng từ mỗi mục tiêu được sắp xếp dưới dạng các chấm nhỏ trên mảng.

Vi mảng DNA có thể được coi như một phiên bản thu nhỏ của dot blot, có khả năng xác định sự hiện diện hay vắng mặt, hoặc ước tính độ phong phú tương đối của một chuỗi nucleotide trong mẫu. Vi mảng bao gồm một số lượng lớn các đầu dò nucleotide cố định. Nucleotide từ mẫu được đánh dấu và ủ với vi mảng, cho phép bất kỳ nucleotide bổ sung nào trong mẫu lai với các mục tiêu cố định. Mẫu không gắn kết sẽ được rửa sạch và bất kỳ nucleotide nào từ mẫu gắn kết sẽ được phát hiện. Thông thường, mẫu được đánh dấu huỳnh quang vì phát hiện huỳnh quang cung cấp độ nhạy tốt và một phạm vi động tuyến tính đủ (Bumgarner). Ngoài ra, phát hiện huỳnh quang cho phép hai hoặc nhiều mẫu được lai với vi mảng trong một thí nghiệm bằng cách đánh dấu mỗi mẫu với một chất huỳnh quang khác nhau. Đồng lai cho phép so sánh hai mẫu trong một thí nghiệm duy nhất, do đó mẫu thí nghiệm có thể được so sánh trực tiếp với mẫu chuẩn hoặc mẫu đối chứng, tránh những biến chứng tiềm ẩn có thể phát sinh từ sự biến đổi giữa các vi mảng.

Để nghiên cứu biểu hiện gen, các đoạn DNA tương ứng với các gen được biểu hiện được đánh dấu trên vi mảng. RNA chiết xuất từ một mẫu được chuyển đổi thành cDNA hoặc cRNA đánh dấu huỳnh quang và được lai với vi mảng. Các gen được biểu hiện sẽ dẫn đến sự phát huỳnh quang của các chuỗi bổ sung trên vi mảng. Đối với genotyping, các đoạn DNA được đánh dấu trên vi mảng được thiết kế để lai với các đa hình nucleotide đơn (SNPs) hoặc các biến thể cụ thể.

Vi mảng cũng có thể được sử dụng để thực hiện lai so sánh bộ gen (CGH), còn được gọi là phân tích vi mảng nhiễm sắc thể (CMA), một phương pháp sàng lọc toàn bộ bộ gen để phát hiện sự biến đổi số lượng bản sao trong DNA bộ gen (Theisen). CGH vi mảng (aCGH) được thực hiện bằng cách đánh dấu huỳnh quang DNA bộ gen từ hai mẫu và lai DNA với một mảng đầu dò đại diện cho chuỗi DNA bộ gen. Sự thay đổi trong cường độ huỳnh quang tương đối của hai mẫu gắn kết cho thấy sự hiện diện của sự thay đổi số lượng bản sao, dù là mất đoạn hay khuếch đại, ngay cả trong các đoạn DNA nhỏ (Theisen).

Việc gắn kết mẫu với các loại đầu dò khác ngoài nucleotide cũng đã được phân tích bằng cách sử dụng vi mảng, bao gồm peptide, carbohydrate và lipid. Ngoài khả năng xử lý song song cao, ưu điểm của phương pháp vi mảng bao gồm quy trình làm việc tương đối đơn giản và kết quả nhanh chóng (Roberts). Một nhược điểm là các xét nghiệm đòi hỏi phải có kiến thức trước để thiết kế vi mảng; vi mảng chỉ có thể kiểm tra sự gắn kết với các mục tiêu được bao gồm trên vi mảng.

Mặc dù giải trình tự gen thông lượng cao (RNA-Seq) đã thay thế phần lớn vi mảng trong các nghiên cứu genotyping và biểu hiện gen, vi mảng vẫn giữ vai trò quan trọng trong các ứng dụng như aCGH cũng như các nghiên cứu về hệ vi sinh vật, tương tác DNA-protein như lập bản đồ các vị trí gắn kết của yếu tố phiên mã, và các sửa đổi DNA như methyl hóa các đảo CpG (Roberts). Ngoài ra, vi mảng còn được sử dụng trong nhiều ứng dụng lâm sàng và chẩn đoán như đặc trưng hóa các dấu hiệu sinh học của khối u, genotyping các loại ung thư để lựa chọn phương pháp điều trị, và genotyping các mô trước khi cấy ghép nội tạng (Roberts).

Việc hình ảnh hóa vi mảng đòi hỏi một máy quét có độ phân giải đủ cao, nguồn sáng phù hợp, phạm vi động rộng và khả năng định vị và lấy nét chính xác trên slide vi mảng. Các hệ thống quét vi mảng chuyên dụng tồn tại nhưng có thể không phải là lựa chọn tối ưu cho một phòng thí nghiệm thường xuyên tiến hành các loại hình ảnh khác. Một hệ thống hình ảnh đa năng như Sapphire FL Biomolecular Imager cung cấp khả năng quét vi mảng cùng với nhiều ứng dụng tương thích khác.

Bài viết ứng dụng này sẽ gợi ý ứng dụng nghiên cứu với khả năng chụp ảnh độ phân giải cao của vi mảng hai màu bằng thiết bị Sapphire FL Biomolecular Imager.

Phương pháp

Một slide hiệu chuẩn máy quét vi mảng (Microarray Scanner Calibration Slide, mã sản phẩm #DS 01 của Full Moon BioSystems) được quét bằng thiết bị Sapphire FL Biomolecular Imager. Slide này chứa hai mảng các chấm chứa loạt pha loãng của thuốc nhuộm CyTM3 hoặc CyTM5. Bố cục của slide được hiển thị trong Hình 1. Khoảng cách giữa các chấm của mảng là 350 µm.

Để quét trên thiết bị Sapphire FL Biomolecular Imager, slide được đặt úp mặt trong phụ kiện giữ slide (sản phẩm IS4053 của Azure Biosystems). Các thông số quét bao gồm Slide (+1.00 mm) cho loại tiêu điểm, kích thước pixel 5 micron (độ phân giải), và tốc độ quét cao nhất. Cy3 được chụp ảnh bằng mô-đun quang học tiêu chuẩn 532 với cường độ laser L4 và Cy5 được chụp ảnh bằng mô-đun quang học tiêu chuẩn 638 với cường độ laser 6.

Kết quả và Thảo luận

Hình ảnh của các vi mảng được quét bằng thiết bị Sapphire FL Biomolecular Imager được thể hiện trong Hình 2. Vi mảng đã được quét bao gồm hai mảng các chấm, một mảng chứa pha loãng nửa đôi liên tục của Cy3 và mảng khác chứa pha loãng nửa đôi liên tục của Cy5. Cy3 được chụp ảnh bằng mô-đun quang học tiêu chuẩn 532 của Sapphire FL. Hình ảnh gốc được hiển thị trong Panel B của Hình 2. Cy5 được chụp ảnh bằng mô-đun quang học tiêu chuẩn 638 và hình ảnh gốc được hiển thị trong Panel C của Hình 2. Panel A hiển thị hai kênh được hợp nhất thành một hình ảnh duy nhất, với kênh Cy3 được hiển thị bằng màu xanh lá cây và kênh Cy5 bằng màu đỏ. Các hình ảnh được chụp với độ phân giải 5 micron, cung cấp hình ảnh rõ ràng về các chấm trên mảng. Khoảng cách giữa các chấm trên mảng là 350 µm.

Các hình ảnh này chứng minh khả năng của Sapphire FL trong việc quét vi mảng và tạo ra các hình ảnh độ phân giải cao sẵn sàng cho phân tích tiếp theo. Sapphire FL đơn giản hóa việc hình ảnh hóa slide để thu được các hình ảnh rõ ràng của slide, bao gồm cả slide vi mảng, một cách đơn giản và trực quan. Khi sử dụng phụ kiện giữ slide, cài đặt tiêu điểm Slide của Sapphire FL cung cấp một mặt phẳng tiêu điểm lý tưởng, hoặc rất gần với lý tưởng. Nếu cần tối ưu hóa tiêu điểm bổ sung, mặt phẳng tiêu điểm có thể được điều chỉnh chỉ với 0.01 mm. Phụ kiện giữ slide giữ slide ra khỏi bề mặt thủy tinh của hệ thống hình ảnh, loại bỏ các mẫu nhiễu mô hình nhiễu Newton. Ngoài ra, phụ kiện này có thể đặt đến 15 slide để quét cùng lúc, từ đó tăng cường năng suất và hiệu quả.

Phần mềm AzureSpot Pro bao gồm nhiều chế độ phân tích cho các loại mẫu khác nhau, bao gồm chế độ Array. Trong phần mềm này, việc xác định các ô hoặc chấm cho các mảng ống đa ô hoặc các mẫu được sắp xếp như vi mảng và dot blot là dễ dàng. Sapphire FL có các mô-đun quang học tiêu chuẩn cho nhiều loại thuốc nhuộm phổ biến, bao gồm Cy3 và Cy5. Ngoài ra, thiết bị này có thể tùy chỉnh hoàn toàn với các mô-đun laser và bộ lọc có thể thay đổi được bởi người dùng, có thể kết hợp để làm việc với gần như bất kỳ chất huỳnh quang nào. Để biết thêm thông tin về Sapphire FL Biomolecular Imager, bạn có thể truy cập vào địa chỉ sau: [https://azurebiosystems.com/products/sapphirefl/](https://azurebiosystems.com/products/sapphirefl/).

References

1. Bumgarner R. DNA microarrays: types, applications and their future. Curr Protoc Mol Bio. 2013;Chapter 22, Unit 22.1. doi: 10.1002/0471142727.mb2201s101

2. Theisen A. Microarray-based comparative genomic hybridization (aCGH). Nat Educat. 2008;1(1):45. https://www.nature.com/scitable/topicpage/microarray-basedcomparative-genomic-hybridization-acgh-45432/

3. Roberts JP. Microarrays still have their uses and fans. Biocompare. Posted Oct 10, 2019. https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/518117-MicroarraysStill-Have-Their-Uses-and-Fans/