AD Group

Phương pháp mới :Thực hiện Bio-AFM trên tế bào sống

Thứ tư, 21/02/2024

Nghiên cứu về các hệ thống sinh học bao gồm cả từ toàn bộ cơ thể sống, các cơ quan và cấu trúc nhỏ hơn của chúng: tế bào và protein. Ở mức độ nhỏ hơn trên thang đo chiều dài, các hệ thống kính hiển vi lực nguyên tử (AFM) đã được áp dụng vào các lĩnh vực khác nhau của nghiên cứu sinh học, như chụp ảnh của tế bào sống và vi khuẩn, thao tác đơn tế bào, hoặc phổ lực lượng trên phân tử, tế bào hoặc thậm chí là mô. Trong bài viết này, chúng tôi sẽ thảo luận về các thí nghiệm sinh học tiên tiến trên tế bào và quy trình để thực hiện các thí nghiệm đó.

Sự kết hợp giữa Bio-AFM với kính hiển vi quang học

Bio-AFM trở nên đặc biệt mạnh mẽ khi kết hợp với các kỹ thuật khác, đặc biệt là với kính hiển vi quang học. Vì lý do đó, Nanosurf cung cấp các loại bệ đỡ mẫu cho tất cả các thương hiệu phổ biến của kính hiển vi soi ngược. Những bệ mẫu này được lắp vào kính hiển vi, cho phép AFM được đặt lên trên mẫu sinh học, giữa kính thu và ống kính. Cũng có một ống kính chuyên dụng, có khoảng cách xa, cho hình ảnh DIC và tương phản pha. Hình ảnh Epi-fluorescence, confocal hoặc STED.

Thiết lập các điều kiện sinh lý

Các tế bào động vật là mẫu nghiên cứu cho các thí nghiệm Bio-AFM. Các thí nghiệm này thường được thực hiện ở nhiệt độ phòng và sử dụng loại đệm cân bằng độ pH, không phụ thuộc vào CO2. Trong khi những điều kiện không sinh lý này có thể mang lại lợi ích và hữu ích để giải quyết một số vấn đề khoa học, chúng tôi xác định rõ ràng không phải là điều tối ưu. Chúng tôi ngăn cản việc thực hiện các thí nghiệm trong thời hạn (> 4 giờ), vì tế bào bào hiện hiện dấu hiệu suy giảm rõ ràng. Hơn nữa, tính hợp lý của một số suy luận khoa học đang được nghi vấn ngay cả trong khoảng thời gian ngắn. Dung dịch đệm điều kiện đã được chứng minh ảnh hưởng đến kênh truyền ion (1), cập nhật phân tử (2), có thể gây độc sáng (3) và thay đổi cứng tế bào tế bào (4), trong khi ảnh hưởng nhiệt độ đến, ví dụ, cứng của tế bào (4) và đo độ bám dính tế bào (5). Để đáp ứng điều kiện sinh học trong thí nghiệm này, Nanosurf cung cấp các phụ kiện như tủ nuôi tế bào sống tương thích với AFM, cung cấp kiểm soát nhiệt độ, độ ẩm và CO2.

Kiểm soát nhiệt độ

Bộ giữ đĩa Petri có thể chứa đĩa nhựa và thủy tinh có đường kính lên đến 50 mm và chiều cao 10 mm. Nó có thể được sử dụng trong các ứng dụng độc lập cũng như kết hợp với kính hiển vi huỳnh quang. Bộ giữ được trang bị các thành phần làm nóng cùng với bộ điều khiển TEC cho phép kiểm soát nhiệt độ của mẫu trong khoảng từ nhiệt độ môi trường đến 60°C. Nhiệt độ có thể được duy trì ổn định trong khoảng ±0.1°C. Đối với nhiều loại tế bào, sự phát triển lý tưởng có thể được đảm bảo khi duy trì nhiệt độ ổn định ở 37°C.

Đối với các thí nghiệm yêu cầu nhiệt độ cực kỳ chính xác, việc làm nóng cục bộ thông qua bộ giữ đĩa Petri có thể không đủ, vì sự chênh lệch nhiệt độ giữa mép của đĩa Petri và trung tâm đĩa. Để giảm thiểu các chênh lệch nhiệt độ trong đĩa Petri, có tùy chọn làm nóng nâng cao nhiệt độ xung quanh toàn bộ kính hiển vi quang học và AFM. Nếu AFM được đặt trong một vỏ bọc cách âm, nhiệt có thể được áp dụng cho toàn bộ thể tích.

Đối với thí nghiệm dài ngày, một bộ đĩa Petri làm nóng cục bộ và một bộ làm nóng vỏ bọc cách âm được kết hợp phù hợp với nhau, với nhiệt độ toàn yêu cầu vào 35°C, ngay dưới nhiệt độ mục tiêu của bộ gia nhiệt cho đĩa Petri . Điều này kết hợp với các chênh lệch nhỏ và thời gian phản ứng ngắn sau khi gắn một mẫu mới hoặc đúc hẫng. Tự động hóa AFM, kính hiển thị quang học và sân khấu giảm thiểu nhu cầu mở vỏ bọc âm thanh để điều chỉnh tia laser, tìm vị trí quan tâm hoặc thay đổi quy trình phóng đại quang học hoặc bộ lọc huỳnh quang.

Nhiệt độ gia tăng cũng làm tăng quá trình bay hơi của dung dịch. Để khắc phục vấn đề này và, thêm vào đó, kiểm soát pH của các môi trường nuôi cấy tế bào phụ thuộc vào CO2, Nanosurf cung cấp tùy chọn Live Cell Incubator .

Điều chỉnh độ ẩm và pH

Live Cell Incubator là một tùy chọn có cấu hình tương đương với tủ ấm nuôi tế bào chứa bệ đỡ đĩa Petri tiêu chuẩn . Tủ giữ kín vòng miệng đĩa Petri, tạo ra hai ngăn, trong khi vẫn cho phép giá đỡ cantilever di chuyển tự do. Ngăn trong bao gồm đĩa Petri kín, trong khi ngăn bên ngoài bao quanh đĩa Petri (xem Hình dưới đây).

Kết hợp Live Cell Incubator với một nguồn khí ẩm phù hợp, sự bay hơi có thể được giảm xuống mức tối thiểu. Cách tiếp cận cơ bản là sử dụng một chai rửa để làm ẩm khí từ bình khí. Trong thực tế, điều này có thể là không khí tổng hợp với 5% CO2, cho phép kiểm soát pH trong các loại môi trường nuôi cấy tế bào phụ thuộc vào CO2 (ví dụ như DMEM).

Ngoài cách tiếp cận cơ bản về làm ẩm, Nanosurf cũng cung cấp một cách tiếp cận tiên tiến về làm ẩm. Cách tiếp cận làm ẩm tiên tiến này cho phép kiểm soát độ ẩm từ môi trường đến 95% độ ẩm tương đối bằng cách sử dụng cảm biến độ ẩm và vi điều khiển. Tùy thuộc vào nhu cầu, Nanosurf cũng cung cấp một giải pháp không cần khí ẩm đóng chai và việc pha trộn không khí với CO2 được thực hiện tại chỗ sử dụng khí dây.

Theo cách mô tả ở trên, điều kiện thí nghiệm có thể được giữ nguyên như môi trường nuôi cấy tế bào. Nhiệt độ chính xác, sự bay hơi thấp và kiểm soát pH không chỉ đảm bảo cái nhìn liên quan đến hệ thống gần giống sinh lý mà còn mở khóa các thử nghiệm diễn ra trong suốt vài ngày, như là nghiên cứu việc hình thành mô (6) với PicoBalance.

Sự truyền chất dinh dưỡng cho môi trường tế bào

Trong khi nghiên cứu tế bào dưới điều kiện sinh lý là rất quan trọng, nghiên cứu cũng đòi hỏi phải can thiệp vào tế bào một cách kiểm soát, ví dụ như bằng cách thay đổi môi trường.

Như một tùy chọn bổ sung cho bệ giữ đĩa Petri, Nanosurf cung cấp insert truyền dịch. Với AFM đặt trên đĩa Petri, sử dụng kèm theo một tủ nuôi Live Cell Incubator , việc trao đổi môi trường hoặc thêm chất hóa học vào đĩa Petri trở nên khó khăn hơn. Đặc biệt, nếu một khu vực cụ thể của đĩa cần phải được xem xét lại, hoặc nếu một thí nghiệm cần phải chạy tự động, việc trao đổi chất lỏng hoặc chèn chất lỏng phải có thể thực hiện được mà không cần sự can thiệp của con người. Để cho phép điều này, insert truyền dịch bao gồm một vòng, trên đó có hai ống cong được gắn từ tính, chúng lại được kết nối với ống linh hoạt. Ống linh hoạt này sau đó có thể được kết nối với, ví dụ, ống tiêm hoặc máy bơm, cho phép thêm chất lỏng hoặc trao đổi môi trường (cơ chế đẩy kéo).

Quang phổ năng lượng tế bào đơn

Bệ đỡ 150 µm là một bệ giữ đĩa Petri , có bộ hoạt động có phạm vi điều chỉnh xa, cho phép điều chỉnh và chuyển bề mặt đĩa một cách chính xác theo chiều cao (trục z), mở rộng phạm vi z của AFM. Điều này đặc biệt quan trọng trong lĩnh vực phổ năng lực tế bào (SCFS), nhưng cũng có thể được sử dụng trong 3D-printing và các ứng dụng khác. Trong SCFS, độ kết dính tế bào có thể được đặc tính hóa ở cấp độ phân tử. Đối với những thí nghiệm này, tế bào có thể được gắn vào cantilever bằng một protein kết dính và sau đó được đưa vào đĩa nuôi. Sau một khoảng thời gian khảo nghiệm, chúng đã được loại bỏ. Ngay cả sau khi thân tế bào không còn tiếp xúc với bề mặt nữa, các sự cố về độ kết dính tế bào đã được ghi lại. Một bộ điều chỉnh cho ống kính cũng có được cung cấp thêm như một sự lựa chọn khác.

Thực hiện thí nghiệm Cell manipulation thông qua FluidFM®

FluidFM kết hợp chức năng của các Cantilever điều khiển được sức mạnh với chức năng của micro-pipet, cung cấp cơ hội duy nhất để điều khiển và khảo sát các tế bào tế bào. Cảm biến FluidFM, là một cantilever rỗng chứ được dung dịch lỏng ở dung tích micro và khe hở ở đầu scan của cantilever, cho phép hút một phần tế bào bào bằng cách sử dụng áp suất âm. Bởi vì lực giữa cantilever và tế bào là đáng kể hơn khi chỉ sử dụng các protein bám dính đơn, nên các phép đo độ bám dính giữa các tế bào bào hoàn toàn có thể được khảo sát với các phép đo thông lượng cao (9).

Việc sử dụng các FluidFM là pipet micro thay vì chức năng mở rộng micro-pipet của FluidFM thậm chí còn xa hơn. Những cantilever siêu nhỏ này có thể được sử dụng để tiêm tế bào theo mục tiêu hoặc ngược lại, rút chất lỏng từ tế bào, ví dụ, cho mục đích của TEM, phân tích protein và PCR hoặc thậm chí là tế bào phiên mã đơn lẻ (11).

Tổng kết

Các thí nghiệm sinh học thường đi kèm với một loạt yêu cầu cụ thể. Điều này có thể liên quan đến việc thiết lập một môi trường gần với sinh lý lý tưởng về nhiệt độ, độ ẩm và CO2, hoặc đối với việc xử lý mẫu, trong trường hợp này là tế bào, thông qua việc sử dụng các hóa chất, tách nó ra khỏi bề mặt của đĩa. Bằng cách cung cấp loạt thiết bị đa dạng này, đặc biệt là các tùy chọn khác nhau cho giá đỡ đĩa Petri (máy làm nóng, Live Cell Incubator, khay tuần hoàn và động cơ piezo), Nanosurf trang bị cho các nhà nghiên cứu các công cụ để tối đa hóa tiềm năng của AFM trong các ứng dụng sinh học.

Danh sách các phụ kiện sử dụng cho quy trình trên

Các thí nghiệm được trình bày trong ứng dụng này đã được thực hiện bằng DriveAFM trên một kính hiển vi quang học đảo ngược của Zeiss. Các thành phần và phụ kiện được sử dụng bao gồm:

Giá đỡ đĩa Petri với chức năng làm nóng

Tủ ổn nhiệt nuôi tế bào Live Cell Incubator

Khay tuần hoàn

Bệ đỡ piezo 150 µm

FluidFM®

DriveAFM của Nanosurf tương thích với tất cả các phụ kiện, trong khi FlexAFM và CoreAFM của Nanosurf tương thích với tất cả các phụ kiện trừ Live Cell Incubator.

Tài liệu tham khảo

1. Hanrahan, J. W. & Tabcharani, J. A.Inhibition of an outwardly rectifying anion channel by HEPES and related buffers.J. Membr. Biol. 116, (1990).

2. Otero, D. et. al. Effects of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid (AH5183) on rat cortical synaptosome choline uptake, acetylcholine storage and release. Brain Res. 359, (1985).

3. Lepe-Zuniga, J. L., Zigler, J. S., Jr & Gery, I. Toxicity of light-exposed Hepes media.J Immunol. Methods 103, (1987).

4. Chiou, Y-W. et. al. The Influence of Physical and Physiological Cues on Atomic Force Microscopy-Based Cell Stiffness

Assessment. PLOS One 8, (2013).

5. Rico, F. et al. Temperature Modulation of Integrin-Mediated Cell Adhesion.Biophys J. 99, (2010).

6. Martínez-Martín, D. et. al., Inertial picobalance reveals fast mass fluctuations in mammalian cells. Nature 550, (2017).

7. Martinez-Martin, D., Müller, D. J., Martin, S., Alsteens, D., Fläschner, G.WO2017012708A1, (2016).

8. Sun, M., Graham, J. S., Hegedus, B., Marga, F., Zhang, Y., Forgacs, G. and Grandbois, M., Multiple membrane tethers

probed by atomic force microscopy, Biophys. J. 89, (2005).

9. Qiu, Y., et. al. Extending applications of AFM to fluidic AFM in single living cell studies. J. Cell Physiol. 237, (2022).

10. Guillaume-Gentil, O. et. al., Tunable Single-Cell Extraction for Molecular Analyses. Cell 116, (2016)

11. Chen, W. et. al., Live-seq enables temporal transcriptomic recording of single cells. Nature 608, (2022).

Thông tin liên hệ

ADGroup

67 Trần Phú, Ba Đình, Hà Nội.

Phone: 0969048489- Ms. Thủy

Phương pháp mới :Thực hiện Bio-AFM trên tế bào sống

DANH MỤC

Tin liên quan

Kỹ thuật Single Particle Cryo-EM

Chiến Lược hình ảnh hóa Cấu Trúc chính xác của Tấm Ngăn Pin

Khám Phá Mẫu Được Hydrat Hoàn Toàn Với Công Nghệ ESEM