mới này được thiết kế để tối ưu hóa năng suất và khả năng phục hồi (Hình 6).
Hình 6 từ Chen et al. Sản xuất sinh học và đánh giá vi rút liên quan đến Adeno cho thấy đặc tính của AAV bằng nhuộm bạc (A) và Western Blot phát quang hóa học (B), được chụp ảnh trên Azure 300. Được cấp phép theo CC BY 4.0.
Để phát triển mô hình sản xuất sinh học mới, nhóm đã đánh giá và tối ưu hóa từng bước của quy trình sản xuất và tinh chế AAV, bao gồm lựa chọn loại tế bào chủ, các thông số chuyển gen, tối ưu môi trường nuôi cấy, tinh chế cột, cũng như cô đặc và lưu trữ vi rút. Ngoài ra, hình thái, hoạt động và biểu hiện gen của AAV được sản xuất cũng được mô tả. Các tác giả lưu ý rằng mô hình này có thể áp dụng cho nhiều loại huyết thanh AAV.
Mô hình mới liên quan đến việc sản xuất AAV trong các tế bào được chuyển gen được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy lỏng. Các tác giả nhận thấy tế bào VPC sản xuất AAV nhiều gấp 5 lần so với tế bào HEK. Họ đã xác định mật độ tế bào tối ưu và tỷ lệ DNA plasmid trên tế bào để chuyển gen tối ưu và xác nhận các điều kiện này bằng bốn kiểu huyết thanh AAV. qPCR huỳnh quang với tính năng phát hiện SYBR Green trên Cielo đã được sử dụng để định lượng lượng AAV trong môi trường nuôi cấy. Các tác giả đã đánh giá quá trình sản xuất virus theo thời gian, tìm ra collection point tối ưu và xác định các điều kiện để đạt được hiệu suất phát tán AAV từ 95%-100%. Để mở rộng quy mô sản xuất, họ chuyển hoạt động sản xuất sang các lò phản ứng sinh học trong bể khuấy và một lần nữa mô tả sự phát triển của tế bào và hiệu giá AAV theo thời gian.
Sử dụng nhiều phương pháp tinh chế sắc kí cột để xác định loại cột, bộ đệm và rửa giải
Việc sản xuất đủ AAV cho các ứng dụng lâm sàng đòi hỏi nhiều hơn là tối đa hóa lượng AAV được tạo ra bởi các tế bào nuôi cấy. Điều quan trọng nữa là phải tách chiết và tinh chế càng nhiều AAV càng tốt, đồng thời duy trì hoạt động của vi rút. Các tác giả đã mô tả nhiều phương pháp tinh sạch bằng cột để xác định sự kết hợp giữa loại cột, bộ đệm và rửa giải với tỷ lệ liên kết và rửa giải cao nhất. Điện di protein SDS PAGE và phương pháp Western blot được sử dụng để đánh giá chất lượng của AAV được sản xuất. Gel protein nhuộm bạc và kết quả Western Blot phát quang hóa học đều được chụp ảnh trên Azure 300 để phát hiện protein Capsid AAV (xem hình đính kèm). Các tác giả đã chứng minh AAV được tạo ra trong hệ thống của họ hoạt động và thúc đẩy sự biểu hiện gen chức năng trong nuôi cấy tế bào và ở chuột.
Các tác giả kết luận rằng mô hình sản xuất sinh học được báo cáo là đáng tin cậy, có thể mở rộng và mang lại tỷ lệ thu hồi AAV chất lượng cao. Họ nhấn mạnh rằng quy trình này có thể được sử dụng với các loại huyết thanh AAV khác nhau và có thể mang lại lợi ích cho nhiều ứng dụng nghiên cứu và lâm sàng.
Thiết bị sử dụng cho nghiên cứu trên: Azure 300 Imager & hệ thống Cielo qPCR
Azure 300 có thể tiến hành chụp ảnh tia cực tím UV và ánh sáng xanh, đồng thời có khả năng nâng cấp hoàn toàn lên Azure 600, một hệ thống chụp ảnh huỳnh quang Western blot. Tìm hiểu thêm về Azure 300 tại đây.
Azure 300 là thiết bị chụp ảnh đa kênh, đa phương thức, với các kênh kích thích huỳnh quang, ánh sáng khả kiến và tia cực tím. Hệ thống này có thể nâng cấp hoàn toàn lên Hệ thống chụp ảnh huỳnh quang Western Blot.
Azure 300 mang đến sự đơn giản, tốc độ và độ nhạy của việc phát hiện phim, với độ phân giải tốt hơn và kết quả định lượng cao hơn. Máy chụp ảnh phát quang hóa học có thể nâng cấp này thay thế phòng tối bằng phim, đồng thời cung cấp khả năng phát hiện phát quang hóa học chính xác và nhanh chóng, cũng như độ nhạy, dải động và độ tuyến tính cần thiết cho phân tích blot lượng.
Hiệu giá virus được đánh giá bằng Cielo. Hệ thống qPCR mạnh mẽ này kết hợp chức năng quét giếng riêng lẻ với sợi quang phát xạ và kích thích theo kênh cụ thể ở mỗi giếng để tăng độ nhạy và tín hiệu trên nhiễu. Tìm hiểu thêm về Cielo tại đây.
Hàng trăm thử nghiệm lâm sàng hiện đang nghiên cứu việc sử dụng các liệu pháp gen do AAV cung cấp để điều trị nhiều bệnh. Để bất kỳ liệu pháp điều trị thành công nào được sản xuất và cung cấp cho bệnh nhân, điều trị AAV cần phải được sản xuất ở quy mô lớn trong khi vẫn duy trì hoạt động và chất lượng.
