CÔNG TY TNHH THIẾT BỊ KHOA HỌC KỸ THUẬT AN DƯƠNG
info@adgroup.vn
Trong một nghiên cứu gần đây được báo cáo trên tập san lừng danh “Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America (PNAS)”, các nhà nghiên cứu từ Trường Y Harvard đã sử dụng khả
năng chụp ảnh phosphor của máy chụp ảnh sinh học phân tử Azure Sapphire để chụp Northern Blot và định
lượng từ Western Blot từ Hệ thống chụp ảnh Azure 600 để xác định các mục tiêu RNA tiềm năng cho nhiều
small RNAs được tìm thấy trong vi khuẩn cơ hội Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)1.
Kể từ khi phát hành ấn phẩm này, Hệ thống chụp ảnh Sapphire FL được sử dụng Sapphire FL, được
thiết kế để trở thành lựa chọn tối ưu trong việc mang lại định lượng chính xác cho axit nucleic và protein
Tìm hiểu thêm về thiết bị chụp ảnh mới này.
Small RNAs (sRNA; còn được gọi là sRNA điều hòa nhỏ) là các chất điều hòa biểu hiện gen quan trọng ở vi
khuẩn có khả năng đáp ứng với các điều kiện môi trường. Chúng không mã hóa protein mà đóng vai trò là phân
tử điều hòa liên quan đến việc điều chỉnh hoạt động của gen thông qua liên kết với các mRNA mục tiêu. sRNA
cũng ức chế dịch mã hoặc ảnh hưởng đến sự ổn định của mRNA. Chúng đóng vai trò quan trọng trong các quá
trình tế bào, bao gồm sự phát triển, đáp ứng căng thẳng và phòng vệ miễn dịch2.
RNA chaperones là các protein chuyên biệt tạo điều kiện thuận lợi cho việc gấp RNA thích hợp và hỗ trợ liên kết
các sRNA này với các mục tiêu RNA của chúng. Chúng hoạt động như những bộ máy hộ tống phân tử, đảm bảo
cấu trúc và chức năng phù hợp của các phân tử RNA trong các điều kiện nội bào khác nhau3. sRNA và RNA
chaperones hoạt động song hành để điều chỉnh chính xác sự biểu hiện gen.
P. aeruginosa là mầm bệnh vi khuẩn gram âm, vi khuẩn cơ hội, được biết đến với khả năng phát triển và thích nghi trong nhiều môi trường khác nhau. Nó là nguyên nhân gây ra hơn 30.000 ca nhiễm trùng ở bệnh nhân bệnh viện mỗi năm và có xu hướng phát triển tình trạng kháng kháng sinh4. Vì vậy, cần nghiên cứu thêm về P. aeruginosa để cải thiện các phác đồ điều trị. Khả năng sống sót và khả năng thích ứng của P. aeruginosa được cho là phụ thuộc vào sự thay đổi mức độ biểu hiện của protein điều hòa, bao gồm cả sRNA, đối với môi trường tế bào. sRNA điều chỉnh sự thay đổi biểu hiện gen ở cấp độ sau phiên mã bằng cách liên kết với các mRNA mục tiêu và ảnh hưởng đến khả năng dịch mã thành protein. P. aeruginosa chứa hơn một trăm sRNA giả định. Tuy nhiên, mục tiêu điều chỉnh chính xác của hầu hết các sRNA này vẫn chưa được biết rõ. Gebhardt và cộng sự đặt ra mục tiêu xác định một số mục tiêu sRNA này và bắt đầu giải mã mạng lưới các tương tác điều hòa liên quan đến sRNA ở P. aeruginosa.
Ban đầu, các nhà nghiên cứu đã xem xét những sRNA nào liên kết với yếu tố chủ điều hòa sau phiên mã nổi bật để sao chép phage Qβ hay Hfq. Hfq là một RNA chaperone được nghiên cứu kỹ lưỡng, đóng vai trò điều tiết quan trọng ở nhiều loại vi khuẩn khác nhau, bao gồm cả P. aeruginosa. Hfq tạo điều kiện thuận lợi cho các tương tác ghép cặp cơ sở quan trọng giữa sRNA và các mục tiêu mRNA tương ứng của chúng bằng cách ổn định các sRNA và điều chỉnh khả năng tương tác với bản phiên mã mục tiêu của chúng. Vì Hfq làm trung gian cho việc ghép đôi giữa sRNA và mRNA mục tiêu, nên nó có thể ảnh hưởng đến động lực dịch mã và tính ổn định của các loài mRNA mục tiêu.
Previously, PhrS was mainly thought to function through pairing with a single target mRNA to regulate the abundance of the MvfR protein. This transcriptional regulator is required for synthesizing signals involved in quorum sensing (i.e. cell-cell communication about bacterial population densities5). Gebhardt and colleagues found PhrS binds many sRNAs, and also explored the possibility that PhrS has a more complex regulatory role that originally thought.
Trước đó, cho rằng PhrS chủ yếu hoạt động thông qua việc ghép cặp với một mRNA mục tiêu duy nhất để điều chỉnh sự xuất hiện của protein MvfR. Bộ điều chỉnh transcriptional này là cần thiết để tổng hợp các tín hiệu liên quan đến quorum sensing (tức là giao tiếp tế bào - tế bào về mật độ dân số vi khuẩn). Gebhardt và đồng nghiệp đã phát hiện ra rằng PhrS kết hợp với nhiều sRNAs, và cũng khám phá khả năng rằng PhrS có một vai trò điều chỉnh phức tạp hơn so với điều mà ban đầu nghĩ.
Trong khi MvfR ảnh hưởng đến quorum sensing trong P. aeruginosa, nó không phải là bộ điều chỉnh transcriptional duy nhất thực hiện điều này. Bộ kích hoạt transcription AntR tác động tiêu cực lên quorum sensing bằng cách kích hoạt sự biểu hiện của các gene antABC. Các nhà nghiên cứu quan sát rằng sự biểu hiện của hai trong số các gene antABC này giảm đi khi PhrS được biểu hiện ngoại vi. Vì việc biểu hiện ngoại vi của một sRNA có thể ảnh hưởng đến khả năng cạnh tranh của sRNAs tự nhiên đối với các mục tiêu giống nhau, các nhà nghiên cứu đã điều tra cách mức độ tự nhiên của PhrS ảnh hưởng đến biểu hiện của các gene antR, antA và antB.
Sử dụng qRT-PCR, sự biểu hiện của antR, antA và antB đã được đo lường ở cả tế bào hoang dã và tế bào đột biến ΔphrS. Đáng chú ý, kết quả cho thấy rằng trong trường hợp thiếu PhrS, sự biểu hiện của những gene này đáng kể cao hơn, dao động từ 5 đến 40 lần so với tế bào hoang dã. Những kết quả này chỉ ra rằng PhrS đang thực hiện điều chỉnh tiêu cực đối với những gene này. Việc điều này phụ thuộc vào sự tương tác trực tiếp giữa PhrS và các mục tiêu antABC của nó hay không vẫn còn chưa biết.
Để bắt đầu giải quyết câu hỏi về việc liệu PhrS có điều chỉnh sự xuất hiện của antR mRNA thông qua tương tác trực tiếp hay không, nhóm nghiên cứu đã tạo ra các biến thể PhrS với thay đổi nucleotide trong khu vực được dự đoán sẽ ghép cặp với antR mRNA (khu vực "seed"). Những thay đổi này được thiết kế để phá vỡ quá trình ghép cặp thông thường giữa antR và PhrSA.
Thực nghiệm này đòi hỏi việc sử dụng các báo cáo viên để theo dõi tương tác PhrS-antR mRNA. Thông qua việc định lượng hoạt động của báo cáo viên, nhóm nghiên cứu có thể đánh giá liệu PhrS và antR mRNA có tương tác trực tiếp hay không. Sự biểu hiện của báo cáo viên antR tăng lên trong tế bào đột biến ΔphrS so với tế bào hoang dã. Đáng chú ý, các biến thể PhrS không thể kìm chế gen báo cáo, trong khi PhrS hoang dã có thể thực hiện điều này. Điều này dẫn đến kết luận rằng PhrS ức chế dịch và/hoặc ổn định của antR mRNA và khu vực "seed" đóng vai trò trong cơ chế này.
Mặc dù các thay đổi trong biểu hiện của antR quan sát được trong tế bào đột biến ΔphrS cho thấy sự điều chỉnh của gen bởi PhrS, nhưng chúng không thể một cách rõ ràng chứng minh sự kết hợp trực tiếp giữa PhrS và antR mRNA. Để khám phá thêm về điều này, nhóm nghiên cứu đã tạo ra 10 biến thể phrS khác nhau, mỗi cái có sự thay đổi đinucleotide trong khu vực seed được dự đoán. Sau đó, họ sử dụng cùng một phương pháp thử nghiệm báo cáo như trên để xem xét cách mỗi biến thể phrS ảnh hưởng đến biểu hiện của antR. Thú vị là, họ phát hiện ra rằng các biến thể có đột biến giữa vị trí 178 và 181 có khả năng giảm khả năng điều chỉnh tiêu cực của antR reporter expression, và đột biến vị trí 179 đến 180 (biến thể SM179) có tác động mạnh mẽ nhất.
Để đảm bảo rằng các kết quả này không phải do sự biểu hiện thay đổi của các biến thể phrS này, Northern blot được thực hiện sử dụng hình ảnh phosphor bởi máy Sapphire (Hình 4F). Northern blot thường được thực hiện để phân tích biểu hiện gen của một hoặc một số lượng nhỏ các gene. Một ưu điểm của việc sử dụng phân tích Northern blotting so với các kỹ thuật phân tích RNA khác là nó hiển thị kích thước của các phân tử RNA, giúp phát hiện sự khác biệt trong quá trình xử lý, như các biến thể của sự cắt ghép. Các đầu dò sử dụng trên Northern blot là các nucleotides RNA hoặc DNA nhỏ. Truyền thống, các đầu dò được đánh dấu bằng radioisotopes, điều này cho phép đo lường lượng RNA để so sánh mức biểu hiện giữa các mẫu.
Nhóm nghiên cứu quan sát thấy rằng tất cả ngoại trừ một trong số các biến thể PhrS đều phổ biến như PhrS hoang dã. Các dữ liệu này hỗ trợ kết luận rằng chuỗi seed của PhrS là cần thiết để điều chỉnh trực tiếp bản sao antR.
Tìm hiểu thêm về Northern blotting tại đây
Cho đến thời điểm này, chỉ có các báo cáo viên antR đã được sử dụng để điều tra mối quan hệ PhrS-antR. Nhóm nghiên cứu mong muốn kiểm tra liệu PhrS có ghép cặp trực tiếp với antR mRNA khi gen này ở vị trí tự nhiên của nó trong genôm hay không. Để giải quyết câu hỏi này, nhóm nghiên cứu đã tạo ra một dòng tế bào đột biến tổng hợp AntR từ vị trí tự nhiên của nó, nhưng bao gồm một thẻ epitope VSV-G (AntR-V) để dễ dàng phát hiện. Họ cũng giới thiệu một thay đổi nhỏ (gọi là đột biến M2C) trong một vùng cụ thể của gene antR. Đột biến này được thiết kế để ngăn chặn PhrS tự nhiên khỏi việc ghép cặp với gene, nhưng nó chứa các cơ sở phù hợp cho một biến thể PhrS cụ thể gọi là SM179. Do đó, đột biến M2C này sẽ cho phép PhrS biến thể SM179 ghép cặp với (và có thể làm điều chỉnh) antR. Ngoài ra, họ đã tạo ra một dòng tế bào phái sinh khác có thể tự nhiên sản xuất PhrS biến thể SM179.
Western blot được chụp ảnh bằng Azure 600 (Hình 4G) cho thấy PhrS biến thể SM179 giảm sự phổ biến của phiên bản AntR-V của M2C, xác nhận sự tương tác trực tiếp của các biến thể này và tính chất điều chỉnh của sự tương tác.
Vì tín hiệu quorum sensing như PQS được điều chỉnh bởi AntR, những kết quả này gợi ý rằng PhrS có thể điều chỉnh quorum sensing thông qua sự tương tác trực tiếp với bản sao antR. Thực sự, nhóm nghiên cứu đã phát hiện ra rằng, khi không có PhrS hoặc trong sự hiện diện của các biến thể antR M2C (nơi PhrS không thể gắn kết với antR), biểu hiện của phân tử quorum sensing PQS giảm. Những kết quả này gợi ý rằng PhrS tham gia vào quorum sensing thông qua việc điều chỉnh các bộ điều chỉnh transcriptional chịu trách nhiệm về quorum sensing.
Gebhardt và đồng nghiệp đã phát hiện ra một mạng lưới rộng lớn các tương tác RNA-RNA trong P. aeruginosa liên quan đến Hfq, 89 sRNA duy nhất và các bản sao mục tiêu của chúng. PhrS được phát hiện tham gia vào việc điều chỉnh hàng trăm các bản sao khác nhau và ảnh hưởng đến các phân tử quorum sensing thông qua một cơ chế phức tạp trước đây không được biết đến.
Additional research using Azure Sapphire Biomolecular Imager and the Azure 600