CUỘC CÁCH MẠNG ĐỘ PHÂN GIẢI CẤU TRÚC PROTEIN

Tiến sĩ Georgios Skiniotis, 
Giáo sư, Sinh học Cấu trúc, Khoa học Photon, Sinh lý học Phân tử và Tế bào
Đồng Giám đốc, Trung tâm Cryo-EM Stanford-SLAC Đại học Stanford

Nhiệm vụ đầu tiên của Georgios Skiniotis với tư cách là giáo sư mới là xây dựng phòng thí nghiệm kính hiển vi điện tử lạnh (Cryo-EM). Kể từ đó, ông đã phát hiện ra hoạt động bên trong của các enzym đóng vai trò như nhà máy sản xuất các hóa chất phức tạp có đặc tính kháng sinh và chống ung thư. Ngoài ra, công trình của ông còn góp phần vào nghiên cứu đoạt giải Nobel về thụ thể kết hợp protein G (GPCRs). Cryo-EM cung cấp cho Skiniotis một cái nhìn chưa từng có về cấu trúc protein phức tạp so với các kỹ thuật cấu trúc khác.

Câu hỏi: Nền tảng của bạn với cryo-EM là gì?

   Là một sinh viên tốt nghiệp tại Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử Châu Âu ở Heidelberg, tôi đã sử dụng Cryo-EM để nghiên cứu Kinesin motor, chụp những bức ảnh chụp nhanh cho thấy cách kinesin “đi” dọc theo một vi ống. Sau này, với tư cách là nhà nghiên cứu sau tiến sĩ trong phòng thí nghiệm của Tom Walz tại Trường Y Harvard, tôi đã học phân tích EM hạt đơn và áp dụng kỹ thuật này để nghiên cứu các tổ hợp thụ thể cytokine xuyên màng. Tôi tiếp tục công việc Cryo-EM khi xây dựng phòng thí nghiệm của mình.

Các đề tài chính trong phòng thí nghiệm của tôi là cấu trúc sinh học của các thụ thể bề mặt tế bào làm trung gian truyền tín hiệu và giao tiếp nội bào. Chúng tôi chủ yếu sử dụng các kỹ thuật tái tạo Cryo-EM và 3D được bổ sung bằng các phương pháp hóa sinh, lý sinh và mô phỏng để có được cái nhìn động về các phức hợp phân tử thực hiện các quá trình này. Trọng tâm chính trong nghiên cứu của tôi là các GPCRs được kích hoạt liên kết với một protein G, một phức hợp tín hiệu trung tâm liên quan đến tất cả các khía cạnh sinh lý của con người. Phòng thí nghiệm của tôi đã sử dụng single-particle negative-stain EM để thu được cấu trúc có độ phân giải thấp đầu tiên của phức hợp protein GPCR/G ở các hình dạng khác nhau.

Câu hỏi: Làm thế nào để Cryo-EM vượt qua những thách thức liên quan đến tinh thể học tia X?

Việc theo dõi cấu trúc của protein màng bằng phương pháp tinh thể học tia X luôn là một thách thức. Lý do chính là để thực hiện chụp X-quang, bạn cần tạo ra các tinh thể chất lượng cao. Đối với các protein màng, đa phần bạn không thể có sự tương tác đầy đủ giữa các lớp protein để tạo ra các tinh thể có trật tự tốt. Ví dụ: GPCRs không có miền nội bào hoặc ngoại bào lớn. Mọi thứ đều được nhúng trong môi trường màng kỵ nước. Để tạo ra tinh thể, bạn cần thiết lập sự tiếp xúc giữa các lớp protein trên lớp protein khác, nhưng bạn không có bất kỳ phần nào của các protein này được tiếp xúc để tạo ra tinh thể. Cryo-EM thì không phụ thuộc vào việc tạo ra tinh thể.

Câu hỏi: Cryo-EM hoạt động như thế nào?

Trong tinh thể học, bạn có kiểu nhiễu xạ phụ thuộc vào sự tán xạ từ hàng nghìn đến hàng triệu hạt, cuối cùng mang lại cho bạn cấu trúc của protein. Đối với Cryo-EM, chúng ta cần mẫu protein chất lượng cao nhưng mẫu này không cần phải ở dạng tinh thể. Chúng tôi đông lạnh nhanh (thủy tinh hóa) mẫu trong một lớp băng rất mỏng và sau đó ghi lại hình chiếu của từng hạt riêng lẻ. Để ghi lại những hình chiếu này, bạn không thể bắt đầu chụp với một tải electron vì điều này sẽ làm hỏng mẫu vật của bạn. Chúng tôi áp dụng các kỹ thuật low-dose để gửi một số lượng rất nhỏ electron để tạo thành hình ảnh. Vì chùm tia có cường độ rất yếu này nên hình chiếu mà chúng tôi ghi lại rất nhiễu. Chúng tôi khắc phục nhiễu bằng cách lấy trung bình quá trình xử lý hình ảnh. Các cấu trúc ba chiều mà bạn nhìn thấy hiện nay trong các bài báo của mọi người là kết quả của các phép chiếu nhiễu trung bình từ hàng trăm nghìn hạt hình ảnh. Thông qua tính trung bình, chúng tôi tăng cường tín hiệu và loại bỏ nhiễu.

Câu hỏi: Ưu điểm Cryo-EM dành cho ngành sinh học cấu trúc?

Điều kỳ diệu của Cryo-EM là nó loại bỏ sự cần thiết của việc tạo tinh thể để thu được một cấu trúc. Điều này mở ra rất nhiều khả năng vì không có nhiều thứ có thể tạo tinh thể. Các cấu trúc nhỏ dễ tạo tinh thể, nhưng sinh học phụ thuộc vào các hợp chất protein lớn, phức tạp và động. Không cần tinh thể, chúng ta có thể ghi lại các hình chiếu của các phức tạp lớn và tính toán các cấu trúc 3D.

Câu hỏi: Lời khuyên của bạn dành cho các nhà nghiên cứu muốn sử dụng cryo-EM là gì?

Điều tôi rất tin tưởng là trừ khi bạn có thể xây dựng một thứ gì đó, bạn sẽ không biết nó hoạt động như thế nào. Đầu tiên hãy tự hỏi mình câu hỏi, bạn có biết cấu trúc này đại diện cho điều gì không? Sự liên quan sinh học là gì?

Nếu bạn muốn thực hiện Cryo-EM thành công, bạn cần có khả năng kiểm soát sinh hóa rất tốt đối với những gì bạn đang xem. Bạn có thể nhận được các cấu trúc, nhưng bạn cần diễn giải các cấu trúc này một cách thành công. Bất cứ khi nào ai đó trong phòng thí nghiệm của tôi tinh chế một loại protein, tôi yêu cầu họ thiết lập các xét nghiệm chức năng để tìm hiểu xem protein đã tinh chế có thực sự hoạt động hay không trước khi họ nỗ lực nhiều để có được cấu trúc. Đúng, cấu trúc sẽ luôn cho bạn biết điều gì đó, nhưng nó cũng có thể gây hiểu lầm nếu bạn không biết liệu thứ bạn đang có trong tay có hoạt động hay không.